Tecan MagicPrep™ NGS
O MagicPrep™ NGS System é uma nova categoria de equipamento de laboratório automatizado que oferece simplicidade com um único botão para a preparação de bibliotecas NGS para plataformas de sequenciamento Illumina.
O MagicPrep™ NGS System fornece uma solução completa que inclui o instrumento, software, scripts pré-otimizados, reagentes e consumíveis.
O MagicPrep™ NGS System integra tudo o que você precisa para a preparação da biblioteca; tudo o que você precisa fazer é adicionar suas amostras.
Revelo™ DNA-Seq Mech para MagicPrep NGS
O kit Revelo DNA-Seq Mech para preparação de bibliotecas MagicPrep™ NGS fornece todos os reagentes para a geração de bibliotecas DNA-Seq no MagicPrep™ NGS System. Este kit apresenta uma ampla faixa de entrada, de 50 ng a 500 ng de DNA genômico prefragmentado, e adaptadores UDI para multiplexação flexível. Este kit, em conjunto com o MagicPrep™ NGS System, oferece uma solução totalmente automatizada para preparação de bibliotecas DNA-Seq com tempo de configuração de 10 minutos.
* O kit Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep NGS foi utilizado para gerar bibliotecas a partir de 100 ng de uma mistura prefragmentada de três genomas bacterianos com diferentes conteúdos de GC (S. aureus (32% GC); E. coli (50% GC) e R. sphaeroides (68% GC)). A fração de leituras de cada genoma é semelhante aos resultados obtidos com um fluxo de trabalho manual, demonstrando baixo viés de GC durante a construção automatizada da biblioteca.
Bibliotecas de alta qualidade a partir de DNA pré-fragmentado
- O fluxo de trabalho otimizado minimiza o viés de GC em comparação com os protocolos manuais padrão.
- A amplificação de PCR de alta fidelidade minimiza a introdução de erros baseados em PCR.
- Fornece cobertura e uniformidade em todo o genoma bacteriano, independentemente do conteúdo de GC.
Revelo™ DNA-Seq Enz para MagicPrep NGS
O kit Revelo DNA-Seq Enz para preparação de bibliotecas MagicPrep™ NGS fornece todos os reagentes para a geração de bibliotecas DNA-Seq no MagicPrep™ NGS System. Este kit apresenta uma ampla faixa de entrada, de 50 ng a 500 ng de DNA genômico intacto, fragmentação de DNA robusta por enzimas e adaptadores UDI para multiplexação flexível. Este kit, em conjunto com o MagicPrep™ NGS System, oferece uma solução totalmente automatizada para preparação de bibliotecas DNA-Seq com tempo de configuração de 10 minutos.
Fragmentação Consistente de DNA
- Fragmentação de DNA pré-otimizada para uma ampla faixa de entrada simplifica o fluxo de trabalho.
- Fragmentação de DNA consistente, independentemente do conteúdo de GC, permite dados de alta qualidade de uma ampla variedade de tipos de amostra.
- Fornece cobertura uniforme em todo o genoma bacteriano, independentemente do conteúdo de GC.
As bibliotecas foram geradas com 100 ng de uma mistura de três genomas bacterianos com diferentes conteúdos de GC (S. aureus (32% GC); E. coli (50% GC) e R. sphaeroides (68% GC)) usando o kit Revelo DNA-Seq Enz para preparação de bibliotecas MagicPrep NGS. Todos os genomas foram representados conforme o esperado nos dados de sequenciamento. A análise do tamanho do fragmento de inserção mostra tamanhos de inserção semelhantes para os três genomas, indicando que a fragmentação de DNA não foi influenciada pelo conteúdo de GC.
*A taxa de sucesso é baseada em dados internos médios. A qualidade e variabilidade das amostras podem afetar a taxa de sucesso.
Somente para uso em pesquisa. Não para uso em procedimentos de diagnóstico.
Revelo™ mRNA-Seq para MagicPrep NGS
O kit de preparação de bibliotecas Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS fornece todos os reagentes para a geração de bibliotecas mRNA-Seq direcionadas no MagicPrep™ NGS System. Este kit apresenta uma ampla faixa de entrada, de 10 ng a 1000 ng de RNA total, e adaptadores UDI para multiplexação flexível. Este kit, em conjunto com o MagicPrep™ NGS System, oferece uma solução totalmente automatizada para a preparação de bibliotecas mRNA-Seq com um tempo de configuração de 10 minutos.
Bibliotecas de mRNA-Seq de alta qualidade
- Fluxo de trabalho totalmente automatizado. Comece com RNA total e o MagicPrep™ NGS realiza todas as etapas de preparação da biblioteca, incluindo a seleção de transcritos poliadenilados.
- Cobertura uniforme em todo o transcrito, permitindo a detecção de variantes de splicing e isoformas durante a análise de dados.
- Dados de alta qualidade com detecção consistente de genes em uma diferença de entrada de 100 vezes.
As bibliotecas foram geradas a partir de 10 (16 bibliotecas), 100 (24 bibliotecas) ou 1000 ng (16 bibliotecas) de RNA total de K562. A análise de dados mostrou métricas gerais de biblioteca semelhantes e detecção consistente de genes em uma diferença de entrada de 100 vezes.
*A taxa de sucesso é baseada em dados internos médios. A qualidade e variabilidade das amostras podem ter impacto na taxa de sucesso.
Apenas para uso em pesquisa. Não é destinado a procedimentos diagnósticos.
Qual é a taxa de sucesso da biblioteca?
O MagicPrep™ NGS System foi projetado para fornecer uma solução simples e confiável para a preparação automatizada de bibliotecas. O MagicPrep™ NGS System foi extensivamente testado para otimizar a formulação de reagentes, o script de automação e os consumíveis, a fim de minimizar falhas na construção de bibliotecas. A taxa de sucesso na construção de bibliotecas do MagicPrep™ NGS foi testada usando amostras de controle com as quantidades recomendadas de entrada e ciclos de PCR. As bibliotecas foram consideradas bem-sucedidas se o rendimento total da biblioteca fosse maior ou igual a 200 ng. A distribuição esperada do tamanho da biblioteca foi confirmada para todas as bibliotecas usando o Fragment Analyzer. A qualidade e o sucesso das bibliotecas são impactados pela qualidade da amostra, quantidade de entrada e possíveis inibidores na amostra. Amostras de qualidade inferior podem apresentar taxas de sucesso variáveis.
Taxa de sucesso média de >99%*
O MagicPrep™ NGS System foi utilizado para gerar bibliotecas para sequenciamento Illumina, utilizando amostras de controle. Um total de 59 corridas (472 amostras), uma combinação de corridas de mRNA-Seq e DNA-Seq, foram realizadas em mais de 10 instrumentos diferentes. A taxa média de sucesso da biblioteca foi calculada para todas as corridas, independentemente da aplicação. No geral, a taxa média de sucesso para o MagicPrep™ NGS System é superior a 99%.
Consistência da biblioteca
O MagicPrep™ NGS System proporciona construção consistente de bibliotecas dentro das corridas e entre múltiplas corridas. Quarenta bibliotecas (5 corridas), começando com 100 ng de RNA total de K562, foram geradas com o kit Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS em um único instrumento. O rendimento total de cada biblioteca é representado graficamente para demonstrar a consistência dos rendimentos das bibliotecas. Cada corrida tem um coeficiente de variação (CV) entre 5,8% e 16,8%, indicando que as oito amostras dentro de cada corrida têm um rendimento consistente. Além disso, os rendimentos das bibliotecas gerados em todas as 5 corridas são semelhantes, demonstrando a consistência do MagicPrep™ NGS System.
*A taxa de sucesso é baseada em dados internos médios. A qualidade e a variabilidade das amostras podem afetar a taxa de sucesso.
Somente para uso em pesquisa. Não para uso em procedimentos de diagnóstico.
Equipamento
P1. Quais são as dimensões e o peso do MagicPrep™ NGS System?
O MagicPrep™ NGS System possui dimensões de 58 cm x 25 cm x 31 cm (L x P x A). O instrumento pesa 18,8 kg.
P2. Quais são as condições ambientais de operação necessárias para a preparação de bibliotecas NGS?
As condições de operação do MagicPrep™ NGS System para a preparação de bibliotecas NGS são:
Equipamento
- Temperatura ambiente: 20 - 26 ˚C
- Umidade: 30 - 60% relativa (sem condensação)
- Altitude: cerca de 500 m acima do nível do mar
P3. Quanto espaço é necessário ao redor do MagicPrep™ NGS System para garantir o fluxo de ar adequado?
O MagicPrep™ NGS System deve ser colocado em um local que forneça espaço suficiente em relação às paredes ou a outros objetos que possam limitar o fluxo de ar. É recomendável ter um espaço desobstruído de pelo menos 15 cm (6 polegadas) nas laterais e na parte traseira do instrumento.
P4. Quais são os requisitos de energia para o MagicPrep™ NGS System?
O instrumento MagicPrep™ NGS requer a seguinte alimentação elétrica: 100-240 VAC, 50-60 Hz.
P5. O que está incluído com o MagicPrep™ NGS System?
O MagicPrep™ NGS System inclui o instrumento, cabo de alimentação, deck de amostras e suporte para o deck de amostras.
P6. Posso usar o MagicPrep™ NGS System com outros reagentes?
Não, o MagicPrep™ NGS System é compatível apenas com os reagentes da Tecan.
P7. Posso realizar uma corrida MagicPrep™ NGS com menos de 8 amostras?
É possível realizar uma corrida MagicPrep™ NGS com menos de 8 amostras. No entanto, os consumíveis são de uso único. Os reagentes não utilizados não podem ser recuperados nem usados em corridas subsequentes.
P8. O que está incluído em um kit Revelo MagicPrep™ NGS?
Cada kit é suficiente para 4 corridas (32 amostras). Cada kit inclui 4 cartuchos de reagentes, contas magnéticas e 4 conjuntos de consumíveis para o deck de amostras.
R1. O que devo fazer se o MagicPrep™ NGS System apresentar um erro?
Execute um ciclo de energia e reinicie o sistema. Para realizar um ciclo de energia, desligue o MagicPrep™ NGS System e aguarde até que a faixa de LED se
DNA-Seq MECH
Q1. Quais materiais são fornecidos com Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS?
Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS consiste em componentes do Deck de Amostra, Cartuchos de Reagentes e um único tubo de contas Agencourt.
Q2. Quais materiais ou equipamentos são necessários ou úteis?
Uma lista abrangente de equipamentos necessários e recomendados pode ser encontrada abaixo:
Equipamentos
- Micropipetas: 0,5–10 μL, 2–20 μL, 20–200 μL, 200–1000 μL.
- Microcentrífuga para tubos de 0,2 mL ou placas.
- Qubit® 2.0, 3.0 ou 4 Fluorômetro (Thermo Fisher Scientific) ou outro fluorômetro apropriado e acessórios para quantificação do DNA de entrada e das bibliotecas finais.
- Sistema 5200 Fragment Analyzer, Agilent 2100 Bioanalyzer ou equivalente para análise eletroforética de ácidos nucleicos.
Reagentes
- Buffer TE com baixa concentração de EDTA, solução 1X, pH 8.0 (Fisher Scientific, Cat. #AAJ75793AP), ou água livre de nucleases (Fisher Scientific, Cat. #AAJ71786K2) para diluir ácidos nucleicos.
- Kit de DNA de Alta Sensibilidade Agilent (Agilent, Cat. #5067-4626) ou equivalente.
Suprimentos e Equipamentos de Laboratório
- Ponteiras de pipeta de barreira (filtradas), livres de nucleases.
- Tubos de PCR de 0,2 mL ou placas de PCR de parede fina de 0,2 mL.
- Soluções de limpeza, como DNA OFF™ (MP Biomedicals, Cat. #11QD0500).
Q3. Que métodos você recomenda para isolamento de RNA?
Recomendamos um método de extração baseado em colunas, incluindo: kits Qiagen QIAprep Miniprep ou DNeasy MiniPrep, kits Zymo Quick-DNA e kits Thermo Fisher PureLink Genomic DNA.
Q4. Posso usar extrações baseadas em fenol-clorofórmio para isolamento de DNA?
Não recomendamos o uso desses métodos, pois qualquer resíduo de solventes orgânicos pode inibir a atividade enzimática subsequente. Se forem utilizados reagentes de fenol-clorofórmio, recomendamos a purificação do DNA em colunas antes de introduzi-lo no kit.
Q5. Quanta DNA é necessária para a geração de bibliotecas?
Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS pode ser usado com 50 ng a 500 ng de DNA purificado e de alta qualidade. Quantidades de entrada fora dessa faixa podem afetar a estequiometria da reação, resultando em bibliotecas subótimas que produzem resultados variáveis e insatisfatórios. O uso de quantidades menores ou de amostras degradadas pode resultar em rendimentos insuficientes, dependendo dos requisitos da plataforma analítica.
Q6. Posso usar Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS com DNA de qualquer organismo?
Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS foi testado com entradas de DNA isoladas de amostras humanas e bacterianas. No entanto, qualquer amostra de DNA deve produzir uma biblioteca sequenciável. Para mais informações, entre em contato com o Suporte Técnico em servicos@rchisto.com.br.
Q7. É necessário fragmentar meu DNA antes de iniciar este protocolo?
Sim, o DNA de entrada deve ser pré-fragmentado antes de ser usado com este kit.
Q8. Não tenho acesso a um instrumento Covaris. Posso usar métodos alternativos de fragmentação?
Avaliamos apenas DNA fragmentado por Covaris durante o desenvolvimento do MagicPrep™ NGS DNA-Seq. Outros meios mecânicos de fragmentação, como sonicação, podem ser adequados. Também oferecemos o Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS, que apresenta fragmentação enzimática de DNA genômico de alto peso molecular.
Q9. A Tecan fornece reagentes para a etapa de fragmentação do protocolo?
A Tecan não fornece os reagentes usados nas etapas de fragmentação. Sugerimos que o instrumento Covaris seja utilizado para a fragmentação do DNA.
Q10. Posso realizar menos de 8 preparações de uma vez?
O Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS realiza 8 preparações a cada execução. Posições vazias não produzirão bibliotecas. Cartuchos de reagentes e componentes do deck de amostra não podem ser reutilizados.
Q11. Posso modificar o número de ciclos de amplificação por PCR recomendados pelo Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS?
Sim, o usuário terá a oportunidade de ajustar o número de ciclos em relação ao valor recomendado selecionado com base na entrada da amostra. A Tabela 2 do Guia do Usuário contém diretrizes sobre o número de ciclos a serem usados, embora algumas amostras possam ter um desempenho melhor com um número diferente de ciclos.
Q12. Meus reagentes estão vencidos. Posso ainda executar o Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS?
Sim, embora não recomendemos o uso de reagentes vencidos, o usuário ainda terá a opção de executar o protocolo depois que o instrumento detectar o uso de reagentes vencidos.
Q13. Quantas bases os adaptadores do Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS adicionam à biblioteca?
Os adaptadores adicionam 133 pb à biblioteca.
Q14. Qual é o tamanho esperado da biblioteca?
As bibliotecas Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS apresentarão uma faixa de tamanho proporcional à entrada de DNA fragmentado fornecida pelo usuário. Para DNA de entrada fragmentado entre 300 e 350 pb, o tamanho total da biblioteca será de 400 a 500 pb.
Q15. Quais sequenciadores são compatíveis com suas bibliotecas?
As bibliotecas Revelo DNA-Seq Mech for MagicPrep™ NGS são compatíveis com plataformas de sequenciamento Illumina que utilizam primers de sequenciamento padrão a bordo.
Q16. Quanta material devo carregar no sequenciador?
Siga as recomendações do fabricante para controle de qualidade da biblioteca, quantificação, balanceamento de cores e carregamento da biblioteca amplificada no sequenciador.
Q17. Que tipo de correção de erro é usada para minimizar o impacto de erros de sequenciamento durante as leituras de índice?
Cada índice possui uma distância mínima de edição de três em relação a qualquer outro índice. Isso permite a correção de erro de um mismatch durante a desmultiplexação. Para obter mais detalhes sobre a estratégia de design de índices, consulte Faircloth BC, Glenn TC (2012), Not All Sequence Tags Are Created Equal: Designing and Validating Sequence Identification Tags Robust to Indels. PLoS ONE 7(8): e42543. doi:10.1371/journal.pone.0042543.
DNA-Seq ENZ
Q1. Quais materiais são fornecidos com o Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS?
O Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS consiste em componentes de deck de amostra, cartuchos de reagentes e um tubo único de contas Agencourt.
Q2. Quais materiais ou equipamentos são necessários ou úteis?
Uma lista abrangente de equipamentos necessários e recomendados pode ser encontrada abaixo:
Equipamentos
- Micropipetas: 0,5–10 μL, 2–20 μL, 20–200 μL, 200–1000 μL.
- Microcentrífuga para tubos de 0,2 mL ou placas.
- Qubit® 2.0, 3.0 ou 4 Fluorômetro (Thermo Fisher Scientific) ou outro fluorômetro apropriado e acessórios para quantificação do DNA de entrada e bibliotecas finais.
- Sistema 5200 Fragment Analyzer, Agilent 2100 Bioanalyzer ou equivalente para análise eletroforética de ácidos nucleicos.
Reagentes
Suprimentos e Utensílios de Laboratório
- Pontas de pipeta de barreira (filtradas), livres de nuclease.
- Tubos de tiras PCR de 0,2 mL ou placas PCR de parede fina de 0,2 mL.
- Soluções de limpeza, como DNA OFF™ (MP Biomedicals, Cat. #11QD0500).
Q3. Quais métodos você recomenda para isolamento de DNA?
Recomendamos um método de extração baseado em coluna, incluindo: kits Qiagen QIAprep Miniprep ou DNeasy MiniPrep, kits Zymo Quick-DNA e kits Thermo Fisher PureLink Genomic DNA.
Q4. Posso usar extrações à base de fenol-clorofórmio para o isolamento de DNA?
Não recomendamos o uso desses métodos, pois qualquer resíduo de solventes orgânicos pode inibir a atividade enzimática subsequente. Se forem usados reagentes de fenol-clorofórmio, recomendamos a purificação do DNA com base em coluna antes de usá-los no kit.
Q5. Quanta quantidade de DNA eu preciso para a geração de bibliotecas?
O Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS pode ser usado com 50 ng a 500 ng de DNA purificado e de alta qualidade. Quantidades de entrada fora dessa faixa podem afetar a estequiometria da reação, resultando em bibliotecas subótimas que produzem resultados variáveis e insatisfatórios. O uso de entradas mais baixas ou amostras degradadas pode produzir rendimentos insuficientes, dependendo dos requisitos da plataforma analítica.
Q6. Posso usar o kit Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS com DNA de qualquer organismo?
O Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS foi testado com entradas de DNA isolado de amostras humanas e bacterianas. No entanto, qualquer amostra de DNA deve gerar uma biblioteca sequenciável. Para obter mais informações, entre em contato com o Suporte Técnico em servicos@rchisto.com.br.
Q7. É necessário fragmentar meu DNA antes de iniciar este protocolo?
Sim, o DNA de entrada deve ser previamente fragmentado antes de ser usado com este kit.
Q8. Não tenho acesso a um instrumento Covaris. Posso usar métodos alternativos de fragmentação?
Avaliamos apenas o DNA fragmentado por Covaris durante o desenvolvimento do MagicPrep™ NGS DNA-Seq. Outros meios mecânicos de fragmentação, como sonicação, podem ser adequados. Também oferecemos o Revelo DNA-Seq Enz para MagicPrep™ NGS, que apresenta fragmentação enzimática de DNA genômico de alto peso molecular.
Q9. A Tecan fornece reagentes para a realização da etapa de fragmentação do protocolo?
A Tecan não fornece os reagentes usados nas etapas de fragmentação. Sugerimos que o instrumento Covaris seja utilizado para a fragmentação do DNA.
Q10. Posso realizar menos de 8 preparações de cada vez?
O Revelo DNA-Seq Mech para MagicPrep™ NGS realiza 8 preparações a cada execução. As posições vazias não produzirão bibliotecas. Os cartuchos de reagentes e os componentes do deck de amostra não podem ser reutilizados.
Q11. Posso modificar o número de ciclos de amplificação PCR recomendados pelo Revelo DNA-Seq Mech para MagicPrep™ NGS?
Sim, o usuário terá a oportunidade de ajustar o número de ciclos a partir do valor recomendado selecionado com base na entrada de amostra. A Tabela 2 do Guia do Usuário contém diretrizes sobre o número de ciclos a serem usados, embora algumas amostras possam ter um desempenho melhor com um número diferente de ciclos.
Q12. Meus reagentes expiraram. Posso ainda executar o Revelo DNA-Seq Mech para MagicPrep™ NGS?
Sim, embora não recomendemos o uso de reagentes expirados, o usuário ainda terá a opção de executar o protocolo após o instrumento detectar o uso de reagentes expirados.
Q13. Quantas bases os adaptadores Revelo DNA-Seq Mech para MagicPrep™ NGS adicionam à biblioteca?
Os adaptadores adicionam 133 pb à biblioteca.
Q14. Qual é o tamanho esperado da biblioteca?
As bibliotecas Revelo DNA-Seq Mech para MagicPrep™ NGS apresentarão uma faixa de tamanho proporcional à entrada de DNA fragmentado fornecida pelo usuário. Para DNA de entrada fragmentado de 300–350 pb, o tamanho total da biblioteca será de 400–500 pb.
Q15. Quais sequenciadores são compatíveis com suas bibliotecas?
As bibliotecas Revelo DNA-Seq Mech para MagicPrep™ NGS são compatíveis com plataformas de sequenciamento Illumina que utilizam primers de sequenciamento padrão a bordo.
Q16. Quanta material devo carregar no sequenciador?
Siga as recomendações do fabricante para controle de qualidade da biblioteca, quantificação, equilíbrio de cores e carregamento da biblioteca amplificada no sequenciador.
Q17. Que tipo de correção de erro é usada para minimizar o impacto dos erros de sequenciamento durante as leituras de índices?
Cada índice tem uma distância mínima de edição de três em relação a qualquer outro índice. Isso permite a correção de erro de uma correspondência durante a desmultiplexação. Para mais detalhes sobre a estratégia de design de índices, consulte Faircloth BC, Glenn TC (2012), Not All Sequence Tags Are Created Equal: Designing and Validating Sequence Identification Tags Robust to Indels. PLoS ONE 7(8): e42543. doi:10.1371/journal.pone.0042543.
mRNA-Seq
P1. Quais materiais são fornecidos com o Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS?
O Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS consiste em componentes do Deck de Amostra, Cartuchos de Reagentes e um único tubo de contas Agencourt.
P2. Quais materiais ou equipamentos são necessários ou úteis?
Uma lista abrangente de equipamentos necessários e recomendados pode ser encontrada abaixo:
Equipamentos
- Micropipetas: 0,5–10 μL, 2–20 μL, 20–200 μL, 200–1000 μL.
- Microcentrífuga para tubos de 0,2 mL ou placas.
- Fluorômetro Qubit® 2.0, 3.0 ou 4.0 (Thermo Fisher Scientific) ou outro fluorômetro apropriado e acessórios para quantificação do DNA de entrada e das bibliotecas finais.
- Sistema 5200 Fragment Analyzer, Agilent 2100 Bioanalyzer ou equivalente para análise eletroforética de ácidos nucleicos.
Reagentes
- Tampão TE com baixa concentração de EDTA, 1X, pH 8.0 (Fisher Scientific, Cat. #75793), para diluir ácidos nucleicos.
- Água livre de nuclease (Fisher Scientific, Cat. #BP2484), para diluir ácidos nucleicos.
- Kit de DNA de Alta Sensibilidade Agilent (Agilent, Cat. #5067-4626) ou equivalente.
Suprimentos e Utensílios de Laboratório
- Ponteiras de pipeta de barreira (filtradas), livres de nuclease.
- Tubos de PCR de 0,2 mL ou placas de PCR de parede fina de 0,2 mL.
- Soluções de limpeza, como DNA OFF™ (MP Biomedicals, Cat. #11QD0500).
P3. Quais métodos você recomenda para o isolamento de RNA?
Recomendamos um método baseado em coluna, incluindo:
- Kit de Purificação de RNA Total Norgen Biotek.
- Kits Quick-RNA™ da Zymo Research.
- Kit de Isolamento de RNA PicoPure® Arcturus.
- Kit Mini de RNA PureLink® da Ambion.
- Kits RNeasy da Qiagen.
Métodos orgânicos, como o Reagente TRIzol®, devem ser seguidos por um método de limpeza baseado em coluna.
P4. Posso usar extrações à base de fenol-clorofórmio, como o TRIzol®, para o isolamento de RNA?
Não recomendamos o uso do TRIzol® ou métodos similares, pois qualquer resíduo de solvente orgânico pode inibir a atividade enzimática subsequente. Se você usar RNA extraído com TRIzol®, recomendamos a purificação do RNA por coluna antes de usá-lo no kit.
P5. Posso usar RNA carreador durante o isolamento de RNA?
Não. O RNA carreador residual pode resultar em baixa qualidade dos dados.
P6. Quanta quantidade total de RNA é necessária para a geração de bibliotecas?
O Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS pode ser usado com 10 ng a 1 μg de RNA total purificado e de alta qualidade (RIN ≥ 7.0). Quantidades de entrada fora dessa faixa podem afetar a estequiometria da reação, resultando em bibliotecas subótimas que produzem resultados variáveis e insatisfatórios. Quantidades de entrada mais baixas podem resultar em rendimentos insuficientes, dependendo dos requisitos da plataforma analítica.
P7. Preciso realizar uma etapa de depleção de rRNA ou enriquecimento de poli(A) antes de processar as amostras com Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS?
Nenhuma etapa de depleção de rRNA ou enriquecimento de poli(A) é necessária. Use RNA total de entrada com Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS.
P8. Você recomenda o tratamento com DNase de amostras de RNA total purificado?
Sim. Ao usar amostras de RNA total purificado, grandes quantidades de DNA genômico contaminante podem amplificar durante o processo. Por esse motivo, recomendamos o tratamento com DNase antes de executar o Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS.
P9. Posso usar o Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS com RNA de qualquer organismo?
O Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS foi projetado e testado apenas com entradas de RNA total isolado de amostras humanas. No entanto, qualquer amostra de RNA de entrada contendo alguma fração da sequência 3'-poli(A) deve gerar uma biblioteca sequenciável. Para obter mais informações, entre em contato com o Suporte Técnico em servicos@rchisto.com.br.
P10. Posso realizar menos de 8 preparações de uma só vez?
O Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS realiza 8 preparações a cada execução. As posições vazias não produzirão bibliotecas. Os Cartuchos de Reagentes e os componentes do Deck de Amostra não podem ser reutilizados.
P11. O Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS depleta o RNA ribossômico (rRNA)?
Não. O Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS utiliza seleção de poli(A) para direcionar transcritos de mRNA poliadenilados, resultando em dados de sequenciamento com contaminação mínima de rRNA.
P12. Posso modificar o número de ciclos de amplificação por PCR recomendado pelo Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS?
Sim, o usuário terá a oportunidade de ajustar o número de ciclos a partir do valor recomendado selecionado com base na entrada da amostra. A Tabela 2 do Guia do Usuário contém diretrizes sobre o número de ciclos a serem usados, embora algumas amostras possam se sair melhor com um número diferente de ciclos.
P13. As bibliotecas do Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS são estruturalmente orientadas?
Sim, as bibliotecas preparadas com o Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS são estruturalmente orientadas. A primeira leitura de sequenciamento representa a fita de sentido.
P14. Meus reagentes estão vencidos. Posso ainda executar o Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS?
Sim, embora não recomendemos o uso de reagentes vencidos, o usuário ainda terá a opção de executar o protocolo após o instrumento detectar o uso de reagentes vencidos.
P15. Quantas bases os adaptadores do Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS adicionam à biblioteca?
Os adaptadores adicionam 133 pb à biblioteca.
P16. Qual é o tamanho esperado da biblioteca?
As bibliotecas do Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS geradas com RNA total humano de alta qualidade contêm inserções com uma média de 300 a 350 pb. O tamanho total da biblioteca será de 400 a 500 pb.
P17. Quais sequenciadores são compatíveis com suas bibliotecas?
As bibliotecas do Revelo mRNA-Seq para MagicPrep™ NGS são compatíveis com plataformas de sequenciamento Illumina que utilizam iniciadores de sequenciamento padrão incorporados.
P18. Quanta quantidade de material devo carregar no sequenciador?
Siga as recomendações do fabricante para controle de qualidade de bibliotecas, quantificação, balanceamento de cores e carregamento da biblioteca amplificada no sequenciador.
P19. Que tipo de correção de erros é usada para minimizar o impacto de erros de sequenciamento durante as leituras de índices?
Cada índice possui uma distância mínima de edição de três em relação a qualquer outro índice. Isso permite a correção de erro de um desajuste durante a demultiplexação. Para obter mais detalhes sobre a estratégia de design de índices, consulte Faircloth BC, Glenn TC (2012), Not All Sequence Tags Are Created Equal: Designing and Validating Sequence Identification Tags Robust to Indels. PLoS ONE 7(8): e42543. doi:10.1371/journal.pone.0042543.
*A taxa de sucesso é baseada em dados internos médios. A qualidade e a variabilidade da amostra podem afetar a taxa de sucesso.
Apenas para uso em pesquisa. Não destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.
Catálogos
Catálogos
Manual de Operação
Guias do Usuário
Ficha de Dados de Segurança
*A taxa de sucesso é baseada em dados internos médios. A qualidade e a variabilidade da amostra podem afetar a taxa de sucesso.
Apenas para uso em pesquisa. Não destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.
Vídeos
Preparação de biblioteca NGS com o toque de um botão - a resposta ao tedioso trabalho manual de preparação.
- O tempo gasto na pipetagem manual acabou — apenas carregue e execute. Configure o sistema e inicie o processo em menos de 10 minutos, permitindo tempo para outros experimentos.
- Preparação confiável e reprodutível de bibliotecas NGS com uma taxa média de sucesso superior a 99%* ao combinar uma nova tecnologia inovadora de dispensação de reagentes com a tecnologia convencional desenvolvida e otimizada ao longo de décadas.
- Automação real e sem necessidade de intervenção, eliminando erros custosos durante a preparação da biblioteca. Com reagentes otimizados, consumíveis e configuração simples para uma operação à prova de erros e dados consistentes, qualquer pessoa pode criar bibliotecas para plataformas de sequenciamento Illumina.
Corrida simples em 10 minutos.
Com o MagicPrep™ NGS System, todos os reagentes e consumíveis são fornecidos pré-alíquotas em um único kit. A única coisa que você precisa fornecer são suas amostras. Não é necessário criar misturas mestras ou tampões. Não é necessário comprar outros reagentes. Basta inserir os cartuchos no MagicPrep™ NGS System, iniciar o processo e continuar o seu dia.
Confiável e reprodutível...
O novo MagicPrep™ NGS System da Tecan atinge uma taxa média de sucesso superior a 99%*. Este sistema utiliza uma tecnologia de dispensação de reagentes inovadora juntamente com tecnologia comprovada para fornecer uma solução confiável e reprodutível, minimizando a possibilidade de erros do usuário. O MagicPrep™ NGS System oferece um fluxo de trabalho totalmente automatizado e reprodutível, permitindo que os laboratórios se concentrem em suas próximas descobertas e não na criação de bibliotecas.
Automação real e sem intervenção.
O MagicPrep™ NGS System oferece automação real sem intervenção adicional do usuário após iniciar o processo. Uma vez iniciado o processo, você pode se concentrar em seus experimentos e deixar que o MagicPrep™ NGS cuide da preparação da biblioteca. O instrumento MagicPrep™ NGS pode armazenar as bibliotecas sem evaporação por até 65 horas. Inicie seu processo a qualquer momento e depois recupere suas bibliotecas quando estiver pronto.
* A taxa de sucesso é baseada em dados internos médios. A qualidade e variabilidade das amostras podem ter um impacto na taxa de sucesso.
Apenas para uso em pesquisa. Não é destinado a procedimentos diagnósticos.